Il cuore della progettazione del laboratorio PCR:
1, layout di laboratorio PCR
Il laboratorio di test di amplificazione PCR è suddiviso in linea di principio in tre aree di lavoro separate: area di conservazione e preparazione dei reagenti, area di preparazione dei campioni, area di analisi dei prodotti di amplificazione e amplificazione. Al fine di evitare la contaminazione incrociata, l'ingresso in ciascuna area di lavoro deve seguire rigorosamente un'unica direzione, ovvero solo dall'area di conservazione e preparazione dei reagenti → area di preparazione dei campioni → area di analisi del prodotto di amplificazione e amplificazione. Il trasferimento dei reagenti e dei campioni tra ciascuna area sperimentale deve essere effettuato attraverso la finestra di trasferimento.
2. Progettazione del sistema di condizionamento e ventilazione del laboratorio e controllo della pressione
Il laboratorio PCR non ha requisiti di livello di purificazione rigorosi, ma per evitare la possibilità di contaminazione incrociata tra le varie aree sperimentali, è consigliabile adottare un modulo di distribuzione completa e di organizzazione dell'aria esausta. Allo stesso tempo, il rapporto tra alimentazione d'aria e scarico deve essere rigorosamente controllato per garantire i requisiti di pressione di ciascuna area sperimentale.
(1) Area di conservazione e preparazione dei reagenti
Le principali operazioni in quest'area sperimentale sono la preparazione dei reagenti di conservazione, l'erogazione dei reagenti e la preparazione della miscela di reazione principale. I reagenti e i materiali utilizzati per la preparazione del campione devono essere trasportati direttamente in quest'area e non attraverso altre aree. Le materie prime reagenti devono essere immagazzinate in questa zona e preparate nei reagenti di conservazione richiesti in questa zona. Per il controllo della pressione del flusso d'aria, quest'area dovrebbe mantenere una leggera pressione positiva all'esterno.
(2) Area di preparazione dei campioni
Le operazioni principali in quest'area sono la conservazione del campione, l'estrazione di acido nucleico (RNA, DNA), la conservazione e l'aggiunta al tubo di reazione di amplificazione e la misurazione della sintesi del DNA. Il gradiente di pressione in quest'area deve essere una pressione positiva rispetto all'area adiacente per evitare che l'inquinamento da aerosol entri nell'area dall'area adiacente. Inoltre, poiché la contaminazione causata da aerosol può verificarsi durante le operazioni di caricamento del campione, evitare di camminare inutilmente in quest'area.
(3) Area di analisi dei prodotti di amplificazione e amplificazione
Le principali operazioni in quest'area sono l'amplificazione del DNA e la determinazione dei frammenti amplificati. Inoltre, in quest'area è possibile eseguire anche l'aggiunta del modello di DNA preparato (dall'area di preparazione del campione) e la preparazione della miscela di reazione principale (dall'area di conservazione e preparazione dei reagenti) in una miscela di reazione. I requisiti del gradiente di pressione in quest'area sono: pressione negativa relativa all'area adiacente per evitare perdite di aerosol da quest'area. Per evitare l'inquinamento causato dagli aerosol, è necessario ridurre al minimo le passeggiate non necessarie nell'area. Le singole operazioni come l'aggiunta di campioni devono essere eseguite su un banco ultra pulito.
3. Prevenzione e controllo dell'inquinamento
La questione centrale della progettazione del laboratorio PCR è come evitare la contaminazione. Nel lavoro reale, sono comuni i seguenti tipi di inquinamento: contaminazione di prodotti amplificati; contaminazione del DNA genomico naturale; contaminazione dei reagenti e contaminazione tra i campioni. Perché una volta che si verifica l'inquinamento, l'esperimento deve essere interrotto fino a quando non viene trovata la fonte dell'inquinamento, il risultato dell'esperimento deve essere invalidato e l'esperimento deve essere ripetuto. Pertanto, è dispendioso in termini di tempo e noioso trovare la fonte di inquinamento intorno al laboratorio dopo che si è verificato l'inquinamento e sprecare manodopera e risorse materiali. Pertanto, per evitare l'inquinamento, la prima priorità dovrebbe essere la prevenzione, non l'eliminazione.
(1) Rigorosa divisione dell'area di lavoro
L'impostazione di ciascuna area sperimentale è ragionevole; ogni area sperimentale dovrebbe avere segni evidenti (come il numero civico accattivante o un diverso colore di fondo, ecc.) per evitare confusione di apparecchiature e reagenti in diverse aree sperimentali.
(2) Impostazioni di sistema ragionevoli
Impostazioni ragionevoli del sistema di climatizzazione e ventilazione, cercare di utilizzare i sistemi di condizionamento dell'aria a consegna completa e di scarico completo; rigoroso controllo della pressione del flusso d'aria per garantire requisiti di pressione diversi in diverse aree sperimentali.
(3) Funzionamento standard
I tecnici del laboratorio prove di amplificazione devono seguire una formazione sul posto di lavoro e solo dopo essere stati qualificati possono essere impegnati nei test clinici di amplificazione genica; durante l'operazione sperimentale l'operatore deve indossare i guanti e cambiarli frequentemente. Inoltre, l'uso di tappi monouso nell'operazione è anche una misura efficace per prevenire l'inquinamento; il lavoro di pulizia è tempestivo e corretto. Al termine del lavoro sperimentale, l'area deve essere pulita immediatamente. Oltre al liquido disinfettante convenzionale per pulire e disinfettare la superficie o alla disinfezione per irraggiamento con luce ultravioletta, anche alcune apparecchiature sperimentali dovrebbero essere autoclavate.
(4) Gestione rigorosa
Controllare rigorosamente il personale in entrata e in uscita dal laboratorio. Il personale che non ha nulla a che fare con l'esperimento non può entrare e uscire dal laboratorio a suo piacimento. Se possibile, predisporre passaggi e porte indipendenti per entrare e uscire dall'intera area sperimentale; ridurre al minimo gli spostamenti non necessari nell'area sperimentale per ridurre la possibilità di contaminazione incrociata; prodotti di amplificazione L'area di analisi è la principale fonte di contaminazione dei prodotti amplificati. Il liquido di scarto non può essere scaricato in laboratorio. Deve essere messo a bagno e disinfettato in un disinfettante e scartato lontano dal laboratorio. Anche i materiali usa e getta come le punte usate devono essere disinfettati. Dopo ammollo e disinfezione, trattamento uniforme, come incenerimento, ecc.; l'area di analisi dei prodotti di amplificazione può utilizzare alcune mutazioni genetiche e sostanze tossiche, e particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla protezione della sicurezza del personale sperimentale.
(5) Strutture di supporto complete di laboratorio
Sono necessarie strutture di supporto complete di laboratorio per garantire il lavoro sperimentale. Le apparecchiature e gli strumenti corrispondenti dovrebbero essere equipaggiati in base ai diversi contenuti sperimentali di ciascun laboratorio, come banchi ultra puliti, centrifughe, campionatori, ecc.