Al fine di prevenire la contaminazione incrociata durante il funzionamento, i requisiti principali per la sua progettazione, costruzione e gestione delle operazioni sono:
1. La progettazione e costruzione del laboratorio, il sistema di lavoro sicuro o le procedure operative standard di sicurezza devono soddisfare i requisiti dell'attuale quotazione GG; Requisiti generali per la quotazione&di biosicurezza di laboratorio; GB 1 9489.
2. La PCR è divisa in quattro aree funzionali in base alle fasi di lavoro, vale a dire l'area di conservazione e preparazione dei reagenti, l'area di preparazione dei campioni, l'area di amplificazione e l'area di analisi del prodotto di amplificazione. Se è dotato di uno strumento PCR fluorescente in tempo reale, è possibile combinare le aree di amplificazione e analisi del prodotto. Ogni area funzionale deve essere chiaramente contrassegnata e le attrezzature e gli articoli in diverse aree funzionali non devono essere mescolati.
La direzione del flusso d'aria del laboratorio PCR può essere eseguita in accordo con l'area di conservazione e preparazione del reagente → area di preparazione del campione → area di amplificazione → area di analisi del prodotto amplificata per impedire ai prodotti amplificati di entrare nell'area pre-amplificata insieme al flusso d'aria. Può essere eseguito in modo da ridurre la pressione dell'aria dall'area di conservazione e preparazione del reagente → area di preparazione del campione → area di amplificazione → area di analisi del prodotto di amplificazione. Può essere ottenuto installando ventilatori di scarico, dispositivi di scarico a pressione negativa o altri metodi fattibili.
3. L'ingresso in ciascuna area di lavoro dovrebbe seguire rigorosamente un'unica direzione, ovvero area di conservazione e preparazione dei reagenti → area di preparazione dei campioni → area di amplificazione → area di analisi del prodotto di amplificazione. Dovrebbero essere utilizzate aree di lavoro diverse (come colori diversi). I lavoratori non devono indossare abiti da lavoro quando escono da ogni area di lavoro.
4. La pulizia del laboratorio deve essere eseguita nella direzione di conservazione dei reagenti e area di preparazione → area di preparazione dei campioni → area di amplificazione → area di analisi del prodotto amplificata. Diverse aree sperimentali dovrebbero avere i propri apparecchi di pulizia per prevenire la contaminazione incrociata.
5. Al termine del lavoro, l'area di lavoro deve essere pulita immediatamente. La superficie del banco di laboratorio nell'area di lavoro dovrebbe essere in grado di resistere agli effetti di disinfezione e pulizia di sostanze chimiche come l'ipoclorito di sodio. L'irradiazione ultravioletta sulla superficie del banco da laboratorio deve essere conveniente ed efficace. Poiché la distanza e l'energia dell'irradiazione ultravioletta sono molto critiche per l'effetto di decontaminazione, è possibile utilizzare una lampada ultravioletta mobile (lunghezza d'onda 254 nm) e, una volta completato il lavoro, può essere regolata per irradiare entro 60- 90 cm sul tavolo sperimentale. Poiché il prodotto amplificato è solo poche centinaia o decine di coppie di basi (bp), non è sensibile ai danni UV, quindi il frammento amplificato irradiato UV deve essere irradiato per un tempo più lungo, preferibilmente durante la notte.
Le funzioni dell'area di conservazione e preparazione dei reagenti sono: la preparazione dei reagenti di conservazione, la distribuzione dei reagenti e la preparazione della miscela di reazione di amplificazione, nonché la conservazione e la preparazione di materiali di consumo come provette e punte per centrifuga. Materiali come reagenti di conservazione e materiali di consumo utilizzati per la preparazione dei campioni devono essere trasportati direttamente nell'area di conservazione e preparazione dei reagenti e non possono passare attraverso l'area di rilevamento dell'amplificazione. I materiali di controllo positivo e i materiali di controllo qualità nel kit non devono essere conservati in quest'area, ma devono essere conservati in quest'area. Area di elaborazione dei campioni.
La funzione dell'area di preparazione del campione è: estrazione di acido nucleico (RNA, DNA), conservazione e aggiunta nella provetta di reazione di amplificazione. Per le operazioni che coinvolgono campioni clinici, devono essere soddisfatti i requisiti di dispositivi di protezione, protezione personale e specifiche operative per i laboratori secondari di biosicurezza. Poiché durante la miscelazione dei campioni e la purificazione dell'acido nucleico possono verificarsi contaminazioni da aerosol, è possibile stabilire condizioni di pressione positiva in quest'area per evitare la contaminazione da aerosol dalle aree vicine. Per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni, dopo aver aggiunto l'acido nucleico da testare, è necessario coprire la provetta di reazione contenente la miscela di reazione. Per materiali potenzialmente infettivi, il coperchio deve essere aperto nell'armadio di sicurezza biologica e devono essere previste procedure chiare per la manipolazione e l'inattivazione del campione.
La funzione della zona di amplificazione è: sintesi del DNA, amplificazione e rilevazione del DNA. Al fine di evitare l'inquinamento provocato dagli aerosol, la camminata nell'area dovrebbe essere ridotta al minimo. Va notato che tutte le provette di reazione testate non devono essere aperte in quest'area.
La funzione dell'area di analisi del prodotto amplificata è: ulteriore analisi e determinazione di frammenti amplificati, come l'ibridazione, l'elettroforesi della digestione enzimatica, la denaturazione dell'analisi del liquido ad alte prestazioni, il sequenziamento, ecc. I prodotti di amplificazione dell'acido nucleico hanno vari metodi di analisi, come i metodi di ibridazione della sonda su membrane o su micropiastre o chip (etichettatura con radionuclidi o etichettatura con nuclidi non radioattivi), elettroforesi su gel di agarosio diretto o digerito, elettroforesi su gel di poliacrilammide, trasferimento meridionale, metodi di sequenziamento degli acidi nucleici, spettrometria di massa, ecc.
L'area di analisi del prodotto di amplificazione è la principale fonte di contaminazione del prodotto di amplificazione nel laboratorio di PCR, quindi è necessario prestare attenzione per evitare di portare il prodotto di amplificazione attraverso gli articoli e gli abiti da lavoro in quest'area. Quando si utilizza il metodo PCR-ELISA per rilevare prodotti amplificati, è necessario utilizzare una rondella per lavare le piastre e il liquido di scarto deve essere raccolto in 1 mol / L HCl e non può essere versato in laboratorio, ma deve essere eliminato dal laboratorio di PCR. Far cadere. La punta usata deve anche essere immersa in 1 mol / L HCl e quindi collocata in un sacco della spazzatura per lo smaltimento secondo le procedure, come l'incenerimento. Poiché quest'area può utilizzare determinate mutazioni genetiche e sostanze tossiche come il bromuro di etidio, l'acrilamide, la formaldeide o i radionuclidi, ecc., Si dovrebbe prestare attenzione alla protezione di sicurezza degli sperimentatori.